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酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒吸附法的起源及原理

閱讀次數(shù)：1333 發(fā)布時(shí)間：2015/1/8 9:26:46

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）　　原理：ELISA可用于測(cè)定抗體，也可用于檢測(cè)杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）； ②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）； ③酶作用的底物（顯色劑）。　　ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個(gè)過程稱為包被，加待測(cè)抗體, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，生成抗原－－待測(cè)抗體－－酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體的量。　　根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同，有以下三種類型的常用方法： 3.1間接法此法是測(cè)定抗體*常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體。加人待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗體）與之結(jié)合。洗滌后，加人酶標(biāo)抗球蛋白抗體（酶標(biāo)抗抗體）和底物進(jìn)行測(cè)定。 3.2雙抗體夾心法此法常用于測(cè)定抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加人待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原）與之結(jié)合。溫育后洗滌，加人酶標(biāo)板中。 3.3競(jìng)爭(zhēng)法此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體。加入待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者竟?fàn)幣c固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，*后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。一、酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗體含量（競(jìng)爭(zhēng)法） 1、儀器設(shè)備酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio－550）；酶標(biāo)板（96孔）；微量注射器。 2、試劑（1）HRP標(biāo)記羊抗兔Ig G（1:1 000，國產(chǎn)）；標(biāo)準(zhǔn)牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；（2）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸餾水稀釋至100 mL。（3）稀釋液與洗滌液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸餾水加至1000mＬ。（4）封閉液：含0.1%明膠0.01mol/L PBS， pH7.4。（5）鄰苯二胺底物溶液（臨用前配制）：臨用前將Na2HPO4·12H2O 2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。（6）終止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。 3、操作方法（1）將抗原結(jié)合在酶標(biāo)板上。取標(biāo)準(zhǔn)IgG（10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度為0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加標(biāo)準(zhǔn)抗原的兩孔為對(duì)照，為反應(yīng)的0%值，將反應(yīng)板于4℃放置一夜（8個(gè)樣品，分3個(gè)平行，4個(gè)100%值孔；共28+2孔）。（2）標(biāo)準(zhǔn)牛IgG與初級(jí)抗體一兔抗牛血清的反應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)IgG（10mg/mL）用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中，其中4個(gè)不加標(biāo)準(zhǔn)牛IgG作為測(cè)量時(shí)的100%值。4℃反應(yīng)放置一夜。（3）封閉板。將包被好的酶標(biāo)板孔內(nèi)液體傾去，進(jìn)行洗滌，各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min，倒掉，如此重復(fù)4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進(jìn)行封閉，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。（4）向酶標(biāo)板中加人標(biāo)準(zhǔn)抗原和抗體的混合物。將標(biāo)準(zhǔn)牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，同是4個(gè)未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標(biāo)板中。37℃放置2h，再洗板4次。（5）加人HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗滌。（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗處反應(yīng)20min后，每孔加人50μL結(jié)束反應(yīng)液以終止反應(yīng)。（7）吸收測(cè)定。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長為492nm下的吸光值。（8）數(shù)據(jù)處理。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以Ig（標(biāo)準(zhǔn)牛IgG含量）對(duì)B/Bo作圖，求得線性方程。其中，C為標(biāo)準(zhǔn)牛IgG含量；B為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)牛IgG吸收值與0%吸收值之差;Bo為100吸收值與0%吸收值之差。