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乳過氧化物酶法（LPO）

閱讀次數(shù)：1298 發(fā)布時間：2012/9/27 13:49:42

本法反應(yīng)溫和，對抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低，一般為20～40%。
　　1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進(jìn)微量過氧化氫對125I-的氧化作用，生成125I+，并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。
　　2．方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。
　�。�1）反應(yīng)液組成：蛋白質(zhì)2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na125i 1m Ci（10μl）、乳過氧化物酶溶液25ng（10μl）、H2O2200ng（10μl）；
　�。�2）在室溫保溫7min；
　�。�3）加入H2O2200ng（10μl）；
　�。�4）過7min再加入H2O2（3μl）；
　　（5）保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng)；
　　（6）10min后加入NaI載體溶液1ml ；
　　（7）按常規(guī)方法分離純化。
　　3．注意事項(xiàng)
　　（1）LPO質(zhì)量好壞，可直接影響標(biāo)記率，LPO應(yīng)在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。
　�。�2）LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。
　�。�3）碘化反應(yīng)速率分析表明，酶的催化速度很快。
　　（4）碘化反應(yīng)在pH4.0～8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行，*適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。
　　（5）H2O2應(yīng)保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對酶的活性將有抑制作用。